近日，南京理工大学陈钱教授、左超教授团队提出了一种基于对向照明实现高分辨率准各向同性三维衍射层析的研究，首次在单个显微成像系统中同时耦合透射角度扫描和反射波长扫描两种照明模式，以扩大光谱支持率，解决由于投影角度有限而导致的缺失锥问题。与仅透射方法相比，该技术使得物函数频谱覆盖支持域突破了单物镜数值孔径的限制，轴向分辨率提升了3倍，最终实现了274 nm的三维准各向同性分辨率。相关研究成果近期作为封面文章发表在ACS Photonics 期刊上。

　　背景介绍

　　光学衍射层析(Optical diffraction tomography，ODT)是一种新型的三维无标记显微成像技术，能够对透明生物样品内部特征进行3D可视化或定量表征。相比于传统荧光成像技术，ODT有效避免了荧光染料在生物样本中的光毒性和光漂白作用，实现了非侵入、无标记3D体积成像，因而被广泛应用于生物物理学、细胞生物学、血液学、微生物学和神经科学研究中，有望为生物医学研究和临床治疗提供更加精准和有效的分析手段。然而，传统ODT显微镜由于单物镜的数值孔径施加的投影角度有限，三维光学传递函数只能覆盖Ewald极限球中的一个蝶形区域(图1)，致使轴向分辨率最高只能达到横向分辨率的三分之一，约为600nm。

图1 三维光学传递函数及成像系统分辨率示意图

　　近年来，为了实现各向同性的ODT成像，记录单一物镜孔径限制之外的特征频率，双物镜对向探测、透射结合背向照明等方法受到越来越多的关注。然而半个多世纪来，定量相位测量仍基于干涉原理。想要实现衍射层析，必须借助于干涉全息来获取样品不同角度下的相位分布再进行频谱合成。额外的背向干涉光路使成像系统结构更加复杂，难以兼容现有的显微镜。同时，使用时间相干照明的ODT技术不可避免地遭受散斑噪声和寄生干扰，对于弱散射的透明生物细胞，其背向散射场是暗场分布，叠加相干光源的散斑噪声之后将形成一个完全的散斑场。因此使用干涉方法难以对总场复振幅进行精确测量，给基于背向散射探测的无位移各向同性高分辨ODT带来了严峻的挑战。

　　图文解读

　　针对上述问题，南京理工大学陈钱教授、左超教授研究团队提出了一种基于对向照明的准各向同性高分辨率傅立叶叠层衍射层析成像技术，采用迭代叠层的方法解决了从暗场图像到复折射率的非线性逆问题，使得获得后向散射暗场信息成为可能。该方法通过同时耦合透射角度扫描和反射波长扫描两种照明方案，能够有效的拓展物函数的频谱覆盖支持域(图2)，在减轻折射率低估问题的同时实现了三维近各向同性高分辨率三维衍射层析成像。

图2 准各向同性高分辨率傅立叶叠层衍射层析成像技术的角度扫描(透射)和波长扫描(反射)对向照明原理及重建算法示意图

　　根据上述研究思路，研究团队搭建了对向照明三维衍射层析成像的显微硬件系统，其装置图、数据获取和重建流程如视频1所示。通过将传统明场显微镜的照明光源替换为可编程LED阵列，可从正向不同照明角度照射待测样品;反射波长扫描照明则由超连续谱光源结合声光可调滤波器进行。LED阵列与声光可调滤波器由FPGA控制，通过同轴电缆与相机同步触发，从而采集样品在对向照明下的两组强度图像堆栈。结合加速自适应松弛策略，利用采集到的两组强度图像重复迭代约束直到结果收敛，得到重建的三维散射势谱。最后进行非负约束正则化处理，即可实现准各向同性高分辨率三维衍射层析重建。

　　上述系统的准各向同性高分辨率三维衍射层析成像能力在特制玻璃纤维样品的成像实验中得到了验证。由于照明角度受物镜数值孔径限制，用仅使用透射方法(FPDT)重建的两根玻璃纤维在交汇处混叠在一起。对向照明方法(OI-FPDT)通过引入后向散射信息，可获得的物函数频谱支持域显著扩大，准确地恢复出样品的轴向形态特征。结果表明，该技术以非干涉和无样品移动的方式，通过耦合透射角度扫描和反射波长扫描照明使仪器的轴向分辨率提升了3倍，并缓解了重建折射率值的失真问题。

　　我们将洋葱从表面解剖，分离成只有一个细胞壁厚度(~ 7 μm) 的果皮，然后清洗并将它们固定在树脂载玻片上，然后通过透射角扫描和反射波长扫描两种照明方案获得两个强度集。实验结果证实，传统仅透射方法由于受单物镜照射角度的限制，使得复杂生物样品的轴向RI重建分辨率和信噪比明显降低。对向照明显微成像方法可以显著提高沿z轴的分辨率，并且可以获得更明确的边缘信息，有望为生命科学与基础医学研究提供重要的影像学支撑。

　　上述工作得到了国家重大仪器专项，国家自然科学基金, 江苏省基础研究计划前沿引领专项，江苏省青年基金项目，中央高校科研专项资助项目，以及江苏省光谱成像与智能感知重点实验室开放基金的支持。

　　总结与展望

　　研究团队提出了基于对向照明的新型衍射层析技术，据我们所知，这是首次在一个显微成像系统中同时耦合透射角度扫描和反射波长扫描两种照明方案，以扩大光谱支持率，解决由于投影角度有限而导致的缺失锥问题。总体而言，采用对向照明对物体的正向透射和背向散射同时进行收集能够有效的拓展物函数的频谱覆盖支持域，并保存生物样品的原生状态，有望在生物医学应用中为非干涉无标记3D显微镜开辟新的可能性。

编辑：严志祥